O coronavírus SARS-CoV-2 foi primeiramente identificado na China em dezembro de 2019, sendo o agente causador da COVID-19 (coronavirus disease 2019).
Toda a detecção imunológica ou de imunodiagnóstico parte do conceito de que qualquer imunoensaio possui três componentes: o antígeno, o anticorpo e a marca. O antígeno que pode ser uma porção do vírus ou da bactéria ou o analito que queremos medir. O anticorpo – que pode representar o soro do paciente ou um anticorpo monoclonal ou policlonal que produzimos. A marca, que é o indicador e quantificador da ligação do anticorpo ao antígeno. Esta marca pode ser – Colorimétrica (geração de cor), fluorométrica (geração de fluorescência), luminescente ou quimioluminescente (luciferase presente no vaga-lume) ou mesmo um coloide metálico (ouro coloidal) presente num teste de imunocromatografia – que hoje se confunde com os ditos testes rápidos.
O antígeno neste caso são proteínas com SARS-CoV-2. O vírus é formado por diferentes proteínas estruturais e não estruturais. As proteínas estruturais são responsáveis por formar a estrutura tridimensional do vírus, enquanto as proteínas não estruturais estão principalmente relacionadas à capacidade do vírus de se replicar no organismo hospedeiro. Do ponto de vista estrutural o vírus possui várias proteínas, porém do ponto de vista do imunodiagnóstico podemos nos concentrar em duas delas:
A proteína N – Nucleocapsídio, que está ligada ao RNA viral e é intracelular (intraviral). Grande parte dos ensaios disponíveis no mercado hoje são direcionados a esta proteína, por dois motivos principais. Primeiro esta proteína é altamente imunogênica – pacientes desenvolvem uma resposta imunológica contra esta proteína. A segunda razão é a relativa facilidade de produção haja visto que ela pode ser produzida por clonagem em bactérias e é bastante estável. Porém, por esta proteína ser intraviral, os anticorpos contra esta proteína não geram imunidade, não sendo neutralizantes. Um anticorpo neutralizante é o anticorpo capaz de prevenir a infecção celular, ou seja impedir a entrada do vírus na célula do hospedeiro.
A proteína S (spike ou espícula) que está presente na superfície viral e é a responsável pela ligação do vírus com as células humanas através do receptor enzima ACE2 (angiotensina converting Enzime 2) que está presente na superfície de algumas células humanas – incluído pneumócitos. Como descrito em outros coronavírus relacionados (como SARS-CoV e MERS-CoV, que causaram epidemias em 2002-2003 e 2011, respectivamente), assim como as pesquisas já realizadas com SARS-CoV-2, mostram que a proteína S é um antígeno imunodominante e que, portanto, se mostra como a proteína mais promissora para o desenvolvimento de vacinas e de ensaios de diagnósticos sorológicos que possam ser correlacionados com a imunidade adquirida de indivíduos que foram infectados com o coronavírus (tanto sintomáticos leves e graves, quanto assintomáticos).
Nosso foco, por esta razão, é a proteína S, que é formada por três regiões S1, S2 e tronco da proteína. A região S1 está relacionada com o Receptor Bind Domain (RBD) que é a exata região contendo os aminoácidos responsável pela ligação e afinidade do vírus com a ACE2, já a S2 é responsável pelos processos de fusão celular e entrada do vírus na célula. Anticorpos contra estas regiões RBD, a região da S1 ao redor do RBD e anticorpos contra a S2 são inibitórios para a penetração do vírus da célula humana.
Anticorpos anti-RBD que bloqueiam este local inibem a ligação do vírus com a célula humana, outros anticorpos anti-S1 podem ainda inibir a ligação por alterações estéricas, que causam alterações conformacionais na proteína e anticorpos contra a S2 podem inibir a penetração do vírus na célula hospedeira. Além disto a presença de glicanas (carboidratos) são fundamentais para a manutenção da estrutura da proteína S e envolvidos na interação do vírus com as células humanas. Desta forma a detecção de anticorpos anti-S total, conformacional e com a presença destes carboidratos seja mais abrangente e representativa da imunidade. Estudos de correlação do ELISA anti-S total e ensaios de neutralização confirmam esta expectativa.
O grande desafio em utilizar a proteína S (total e conformacional) como antígeno em imunodiagnóstico está no fato que esta proteína é uma proteína grande (aproximadamente 1.300 anino ácidos) e de estrutura muito complexa (glicosilada), desta forma as células hospedeiras necessárias para produzir esta proteína na sua forma recombinante são células de mamíferos, e não bactérias. Isto afeta a produtividade e eleva dramaticamente o custo e a complexidade de produção desta proteína em comparação com a proteína N. Além disto, a complexidade tridimensional da proteína S faz com que ela não seja a primeira escolha no desenvolvimento de testes rápidos e da maioria dos ensaios laboratoriais disponíveis.
Notadamente a utilização de sequências (peptídeos) menores da proteína S mesmo que representativos da região S1 e/ou S2 limitam de forma significativa a quantidade de epítopos utilizados, reduz de forma significativa (entre 20 à 30%) a quantidade e qualidade dos anticorpos detectáveis. Esta redução pode causar em alguns pacientes que o teste seja interpretado como negativo, mesmo que o paciente tenha efetivamente anticorpos quando medido utilizando o antígeno correto: Proteína S total, conformacional e contendo carboidratos, como o antígeno que é utilizado no ImunoScov19.
Desenvolvemos uma plataforma ELISA indireto, para detecção de anticorpos classe IgG anti proteína S total (S1+S2) do SARS-CoV-2.